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Tierphysiologie

Prof. Dr. rer. nat. Helmut Wieczorek

Prof. Dr. rer. nat. Helmut Wieczorek

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Biologische Membranen trennen lebende Zellen von ihrer Umgebung und ermöglichen intrazellulär die Bildung von abgeschlossenen Kompartimenten, den Organellen. Membranen sind selektiv permeabel für Ionen und Nährstoffe und ermöglichen mittels sogenannter Transportproteine den Stoffaustausch.  Die AG Tierphysiologie beschäftigt sich vorwiegend mit der Struktur, Funktion und Regulation wichtiger Transportproteine, die mit einem breiten Spektrum biochemischer, molekulargenetischer, zellbiologischer und physiologischer Methoden untersucht werden.

Abbildung 1 Reversible Dissoziation der V-ATPase. Das aktive, aus 12 unterschiedlichen Untereinheiten bestehende Holoenzym zerfällt unter bestimmten Bedingungen in die V1- und VO-Komplexe sowie die V1-Untereinheit C und wird damit inaktiviert. In der oberen Reihe sind die untersuchten Organismen dargestellt.

Im Mittelpunkt des Interesses steht die V-ATPase, eine bei allen Tieren, Pflanzen und Pilzen vorkommende Protonenpumpe [Abbildung 1]. Die ergiebigste in der Natur vorkommende Quelle für biochemische Analysen dieses aus zwölf   verschiedenen Untereinheiten bestehenden Proteins sind die Raupen des Tabakschwärmers Manduca sexta. Aus Zellmembranen des Mitteldarms lassen sich vergleichsweise einfach und schnell Milligramm-Mengen an V-ATPase isolieren. Unsere bisherigen Untersuchungen an diesem Protein führten zu einer Reihe allgemeiner Einsichten in seine Struktur, Funktion und Regulation. So haben wir z.B. bestimmte Untereinheiten zum ersten Mal molekular identifiziert, die ersten Strukturuntersuchungen bei dieser Proteinfamilie vorgenommen, einen für V-ATPasen allgemeingültigen Regulationsmechanismus, die reversible Dissoziation des Gesamtproteins in den V1 und den VO-Komplex, entdeckt und erstmals die Untereinheit identifiziert, an die bestimmte bakterielle Hemmstoffe binden.

Abbildung 2 Links die Fluoreszenzaufnahme einer transgenen Drosophila-Larve, die eine V-ATPase Untereinheit mit gekoppeltem GFP exprimiert. Rechts sind Hefezellen zu sehen, bei denen die V1-Untereinheit Cmit grün fluoreszierendem Protein (GFP) fusioniert wurde. Fluoreszenzaufnahmen, die die Lokalisation von C in Gegenwart von Glucose (2 und 4) und Galactose (3) zeigen. Beim Wechseldes Mediums von Glucose zu Galactose dissoziiert C reversibel von der Vakuolenmembran und gelangt in das Cytoplasma.

Weitere von uns bearbeitete Modellobjekte sind die Taufliege Drosophila, die Stechmücke Aedes und die Bäckerhefe Saccharomyces. Der Vorteil dieser Organismen ist ihr vollständig entschlüsseltes Genom, was es ermöglicht, die Gene für die Untereinheiten der V-ATPase gezielt zu mutieren und dann mit definiert veränderten V-ATPasen zu experimentieren. Derzeit wird v.a. der Mechanismus der reversiblen Dissoziation [Abbildung 2] und der inhibitorische Einfluss neuentdeckter Naturstoffe aus Bakterien untersucht [Abbildung 3]. Letzteres ist auch unter medizinischen Gesichtspunkten von Interesse, da die V-ATPase sowohl bei der Metastasenbildung von Tumoren als auch bei Krankheiten wie der Osteoporose eine bedeutende Rolle spielt (Huß, Vitavska und Wieczorek).

Abbildung 3 Bakterielle Hemmstoffe von V-ATPasen, Bafilomycin aus Streptomyceten (links) und Archazolid aus Myxomyceten (rechts). In der Mitte das Modell des Ringes aus 10 c-Untereinheiten des VO-Komplexes, welche abwechselnd hell- und dunkelgrau eingefärbt sind. An der Bindung der Hemmstoffe (gelb bzw. grün) beteiligte Aminosäuren sind blau, rot und orange eingefärbt.

Ein weiteres Arbeitsgebiet betrifft den Transport von Zuckern über tierische Membranen. Einem allgemeinen Lehrbuch-Dogma zufolge verfügen Tiere nur über Transportmechanismen für Monosaccharide wie z.B. dem Traubenzucker Glucose, komplexere Zucker müssen vor dem Transport über die Membran gespalten werden. Bei der Taufliege Drosophila haben wir erstmals ein Membranprotein nachgewiesen, das den „Haushaltszucker“ Saccharose, ein Disaccharid, transportiert [Abbildung 4]. Das Protein kommt zum einen in der Membran von Melanosomen vor, in denen Saccharose für die osmotische Balance bei der Melanin-Synthese verantwortlich sein könnte. Zum anderen ist es in der Zellmembran von Epithelzellen des Darms lokalisiert, wo es möglicherweise für die Aufnahme von Saccharose aus der Nahrung verantwortlich ist. Da Gene für ein entsprechendes Protein auch beim Menschen vorkommen und Mutationen zu spezifischen Krankheitsbildern wie zum Beispiel bestimmten Formen von Albinismus führen, untersuchen wir dessen Funktion auch bei Säugetieren (Vitavska und Wieczorek).

Abbildung 4 Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis des Saccharose-Transporters bei Drosophila. Links die Lokalisation in Melanosomen-Membranen von Follikelzellen der Ovarien, rechts die Lokalisation im Darmepithel eines späten Embryos.

Ein drittes Arbeitsgebiet beschäftigt sich mit der Analyse des komplexen Bewegungsverhaltens einzelliger Wimperntierchen. Hierbei werden mit elektrophysiologischen Methoden Ionenkanäle untersucht, die die komplexe Cilienbewegung steuern (Krüppel). Abbildung 5 zeigt eine Membranpotentialmessung am marinen Ciliaten Euplotes vannus/crassus. Die Bewegung der Cilien wird durch das Membranpotential gesteuert. Mit elektrophysiologischen Mikroelektrodentechnologien können die Potential- und  Calciumabhängigen Ionenkanäle dieses Einzellers analysiert werden.

Abbildung 5

Literaturauswahl

  • Meyer, H., Vitavska, O. and Wieczorek, H. (2011) Identification of the first animal disaccharide transporter. J. Cell Science, in press
  • Bockelmann, S., Menche, D., Rudolph, S., Bender, T., Grond, S., von Zezschwitz, P., Stephen Muench, S., Wieczorek, H., and Huss, M. (2010) Archazolid A binds to the equatorial region of the c-ring of the vacuolar H+-ATPase. J. Biol. Chem. 285, 38304-38314
  • Muench, S.P., Huss, M., Phillips, C., Wieczorek, H., Trinick, J., and Harrison, M.A. (2009) Cryo-electron microscopy of the vacuolar ATPase motor reveals its mechanical and regulatory complexity. J. Mol. Biol. 386, 989-999
  • Vitavska, O., Merzendorfer, H., and Wieczorek, H. (2005) The V-ATPase subunit C binds to polymeric F-actin as well as to monomeric G-actin and induces cross-linking of actin filaments. J. Biol. Chem. 280, 1070-1076
  • Sumner, J.P., Dow, J.A.T., Earley, F., Klein, U., Jäger, D., and Wieczorek, H. (1995) Regulation of plasma membrane V-ATPase activity by dissociation of peripheral subunits. J. Biol. Chem. 270, 5649-5653