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Biologie


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Biophysik

Prof. Dr. rer. nat.  Jacob Piehler

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Zur Abwehr von Pathogenen besitzt der menschliche Körper ein Repertoire von verschiedenen Zelltypen, die in den verschiedenen Organen des Immunsystems zu ihrer vollen Funktion heranreifen. Um den Einsatz gegen eindringende Viren oder Bakterien zu koordinieren, müssen diese Zellen miteinander kommunizieren. Dazu verwenden sie Botenstoffe – die Zytokine – welche über spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche erkannt werden. Die AG Piehler der Biophysik erforscht, wie durch die Wechselwirkung zwischen Zytokinen und ihren Rezeptoren unterschiedliche Signalwege und zelluläre Antworten moduliert werden können. Um diese Prozesse isoliert und im Kontext der Zelle quantitativ zu charakterisieren werden verschiedene spektroskopische und mikroskopische Methoden eingesetzt.

Typ I Interferone sind Zytokine, die als unmittelbare Antwort auf einen Angriff durch Viren oder Bakterien ausgeschüttet werden, um einerseits Zellen direkt zu alarmieren und um andererseits Zellen des adaptiven Immunsystems zu aktivieren. Interferone sind kleine Proteine, welche an bestimmte Rezeptoren an der Zelloberfläche binden. Abbildung 1 zeigt die Signalaktivierung über den Typ I Interferonrezeptor. Durch gleichzeitige Wechselwirkung von Interferonen mit den zwei Untereinheiten IFNAR1 und IFNAR2 werden über assozierte Tyrosinkinasen verschiedene Signalwege aktiviert, die zur Transkription eines breiten Spektrums von Genen führen (Bildteil A). Die spezifische Erkennung von Interferonen durch den Rezeptor beruht auf einer Vielzahl gleichzeitiger nicht-kovalenter Wechselwirkungen, für die Aminosäurereste an der Oberfläche der Proteine verantwortlich sind (Bildteil B). Teil C zeigt, daß sich verschiedene Interferone vor allem in der Stabilität der Komplexe mit IFNAR1 und IFNAR2 unterscheiden. Die Dissoziation verschiedener Interferone von der Rezeptoreinheit IFNAR2 wurde spektroskopisch in Echtzeit verfolgt. 

Abbildung 1 (Erläuterungen zu den Abbildungen jeweils im Text)

Durch gleichzeitige Wechselwirkung von Interferonen mit den beiden Untereinheiten des Rezeptors (IFNAR1 und IFNAR2) werden verschiedene Signalwege in der Zelle aktiviert, die zur Expression von Genen für die Abwehr von Pathogenen führen. Viele nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Aminosäuren der Interferone mit denen von IFNAR1 und IFNAR2 führen zur einer spezifischen, definierten Erkennung dieser Botenstoffe (Abbildung 1b). Während die Raumstruktur der Komplexe von verschiedenen Interferonen mit IFNAR1 und IFNAR2 nur geringe Unterschiede zeigen, ist die Dynamik der Wechselwirkung stark unterschiedlich (Abbildung 1c). Über Proteinmutagenese und Proteindesign konnte gezeigt werden, dass die Dynamik der Interferon-Rezeptor-Wechselwirkung die Akzentuierung verschiedener zellulären Antworten reguliert. Dies auf molekularer und zellulärer Ebene zu verstehen ist die zentrale Fragestellung in der Arbeitsgruppe. Um diese Prozesse in lebenden Zellen zu untersuchen werden hochsensitive fluoreszenzmikroskopische Verfahren verwendet, mit denen einzelne Rezeptoren auf der Plasmamembran der Zelle detektiert und über die Zeit verfolgt werden können. Abbildung 2 zeigt die raum/zeitliche Dynamik des Interferon-Rezeptor-Komplexes in der Plasmamembran: A - mögliche Wechselwirkungen der verschiedenen Komponenten des Signalkomplexes mit Gerüstproteinen im Kontext des Zytoskeletts. B - fluoreszenzmikroskopische Lokalisation und Verfolgung einzelner Rezeptormoleküle in der Plasmamembran. In blau sind die Trajektorien einzelner Rezeptoren gezeigt. C - Trajektorien einzelner IFNAR2-Moleküle im Kontext des Membran-Skeletts, welches mittels Höchstauflösungs-Mikroskopie abgebildet wurde. D: Kolokalisation der transienten Bindung des Effektorproteins STAT2 (grün) mit dem Membranskelett (rot). Durch Einzelmoleküllokalisierung konnten Strukturen deutlich unterhalb der Beugungsbegrenzung aufgelöst werden.

Abbildung 2

Diese Empfindlichkeit wird benötigt, da die Rezeptorproteine nur in wenigen Hundert Kopien pro Zelle vorliegen. Zudem kann mit dieser Methode die Heterogenität der Bewegung und der Verteilung der Rezeptorproteine mit einer Ortsauflösung von wenigen Nanometern detektiert werden. Dafür wurden Methoden etabliert, um geeignete Fluoreszenzsonden selektiv an Zielproteine anzuheften. Mit diesem Ansatz soll die spatiotemporale Dynamik der Assemblierung der Rezeptoren und der Signalweiterleitung in der Zelle aufgeklärt werden, um diese mit der Dynamik der Interferon-Rezeptor-Wechselwirkung zu korrelieren. Zudem werden einzelne Komponenten des Signalkomplexes isoliert in artifiziellen Membranen rekonstituiert, um Wechselwirkungen und Konformationsänderungen unter kontrollierten Bedingungen zu charakterisieren. Dafür werden in der Arbeitsgruppe Oberflächenarchitekturen entwickelt, mit denen Proteine auf Substraten immobilisiert und Membranproteine in Membranen inkorporiert werden können, ohne dabei ihre funktionelle Integrität zu beeinträchtigen. Durch Mikrostrukturierung dieser Oberflächenarchitekturen können Interaktionen und Bewegungen in der Membran begrenzt werden. Abbildung 3 zeigt die quantitative Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Mikrostrukturen auf Einzelmolekülniveau. Teil A - schematische Darstellung der Immobilisierung eines Rezeptorproteins auf einem mikrostrukturiert funktionalisierten Substrate und anschließende Wechselwirkung mit einem Bindungspartner. B - Die kumulative laterale Verteilung von Bindungsereignissen über 1000 Einzelbilder zeigt selektive Bindung in funktionalisierte Areale (markiert durch das gepunktete Quadrat). C - Die Häufigkeitsanalyse der Dauer von einzelnen Bindungsereignissen erlaubt die Bestimmung der mittleren Stabilität der Wechselwirkung. So können spektroskopische und mikroskopische Untersuchungen von Wechselwirkungen und Konformationsänderungen an einzelnen Molekülen durchgeführt werden.

Abbildung 3

Literaturauswahl

  • You, C., Wilmes, S., Beutel, O., Lochte, S., Podoplelowa, Y., Roder, F., Richter, C., Seine, T., Schaible, D., Uze, G., Clarke, S., Pinaud, F., Dahan, M. & Piehler, J. (2010). Self-controlled monofunctionalization of quantum dots for multiplexed protein tracking in live cells. Angew Chem Int Ed Engl 49, 4108-12.
  • Strunk, J. J., Gregor, I., Becker, Y., Li, Z., Gavutis, M., Jaks, E., Lamken, P., Walz, T., Enderlein, J. & Piehler, J. (2008). Ligand Binding Induces a Conformational Change in ifnar1 that Is Propagated to Its Membrane-Proximal Domain. J Mol Biol 377, 725-739.
  • Uze, G., Schreiber, G., Piehler, J. & Pellegrini, S. (2007). The receptor of the type I interferon family. Curr Top Microbiol Immunol 316, 71-95.
    Jaks, E., Gavutis, M., Uzé, G., Martal, J. & Piehler, J. (2007). Differential receptor subunit affinities of type I interferons govern differential signal activation. J Mol Biol 366, 525-539.
  • Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R. & Tampe, R. (2007). Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nature Nanotechnology 2, 220-225.

Biophysik - Membrantransport

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Forschungsschwerpunkte:

Membrantransport, molekulare und physiologische Aspekte von Ionenkanälen, Protein-Transport-Poren, Metabolit-Poren & Transportern, Protein-Protein Wechselwirkungen in /an Membranen.

Die Forschungsarbeiten der Arbeitsgruppe sind im Wesentlichen auf folgende Themenbereiche fokussiert:

  • Mechanismen und Regulation des Proteinimportes in Chloroplasten und Mitochondrien
  • Mechanismen und Regulation des sekretorischen Proteintransportes am Endoplasmatischen Retikulum
  • Metabolit Kanäle in den äußern Membranen von Chloroplasten und Mitochondrien und Regulation des Metabolittransportes über diese Membranen
  • Struktur & Funktion von prokaryontischen Ionenkanälen


Methodisch werden vielfältige biophysikalische (Elektrophysiologie, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie/Spektroskopie, CD-Spektroskopie), sowie biochemische und molekularbiologische Techniken eingesetzt.