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Biologie


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Molekulare Zellbiologie

Prof. Dr. Joost Holthuis, Ph.D.

Prof. Dr. Joost Holthuis, Ph.D.

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Zellbiologie von Membranen und Lipiden

Eukaryotische Zellen zeichnen sich durch unterschiedliche, von Membranen umgebene Organellen aus. Diese Kompartimentierung verbessert den Wirkungsgrad lebenswichtiger chemischer Reaktionen, führt gleichzeitig jedoch zu einem großen Kommunikationsbedarf zwischen den Kompartimenten und dem Austausch von Metaboliten. Besonders herausfordernd ist die Beantwortung der Frage, wie Zellen die genaue Verteilung einer großen Anzahl von strukturell und funktionell unterschiedlichen Membranlipiden auf die Organellen bewerkstelligen. Ohne entsprechende Mechanismen zur Kontrolle der Lipid-Balance und des gerichteten Lipidtransports würden sich die Lipide gleichmäßig auf alle Organellen verteilen, die damit ihre Identität und biologische Funktion verlören.

Die Arbeitsgruppe untersucht, wie Zellen die Lipid-Diversität und definierte Lipidverteilungen aufrechterhalten. Das Forschungsgebiet umfaßt die zugrunde liegende Proteinmaschinerie aus Lipid-Konvertern, –Sensoren und –Flippasen mitsamt möglicher Fehlfunktionen, die systemische Ausfälle und letztlich Krankheiten bedingen.

Abbildung 1 Der Verlust der Golgi-Flippasen Drs2p und Dnf3p aus der Hefe hebt die Phosphatidylethanolamin-Asymmetrie von post-Golgi sekretorischen Vesikeln auf. (a) Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, daß sec6 Mutanten der Hefe post-Golgi sekretorische Vesikel (SV) bei einer nicht-permissiven Temperatur von 38°C anreichern. (b) Elektronenmikroskopische Aufnahme von post-Golgi sekretorischen Vesikeln aus bei 38°C inkubierten sec6-Zellen. Die Vesikel wurden durch differentielle Zentrifugation gereinigt und durch Negativfärbung mit Uranylacetat sichtbar gemacht. (c) Sekretorische Vesikel aus sec6- und sec6?drs2?dnf3-Zellen wurden mit Trinitrobenzolsulfonat (TNBS) bei 25 °C in Gegenwart von ATP inkubiert. Nach 30 min wurde die Reaktion durch Glycylglycin gestoppt, die Vesikelmembranen wurden einer Lipidanalyse unterzogen. Die prozentualen Anteile des TNBS-reaktiven zytosolischen und des nicht reaktiven exoplasmatischen Phosphatidylethanolamins werden gezeigt.

Die Verfügbarkeit vollständiger Genome erlaubt keine aussagekräftigen Vorhersagen der dynamischen Eigenschaften zellulärer Membransysteme. Daher wird die Aufklärung der Wechselbeziehungen zwischen Lipiden und Proteinen die Zellbiologen noch viele Jahre beschäftigen. Durch eine Bioinformatik-gesteuerte Klonierstrategie haben wir eine Familie Sphingolipid-synthetisierender Enzyme identifiziert, die Membranreifungen durch den Wandel von flüssigeren in festere Membrandoppelschichten hervorrufen. Wir leiten diese Enzyme von späten in junge sekretorische Kompartimente um. Damit versuchen wir neue molekulare Prinzipien der Kompartimentierung besser zu verstehen.

Darüber hinaus haben wir grundlegende Studien der Lipid-Pumpen durchgeführt, die für die Erzeugung der Lipid-Asymmetrie in späten sekretorischen Kompartimenten verantwortlich sind (Abbildung 1). Diese sogenannten Flippasen drehen bestimmte Lipide um 180° senkrecht zur Membranebene. Wir entdeckten, dass sie aktiv an der Bildung von endozytotischen Vesikeln an der Plasmamembran beteiligt sind. Dieser Befund steht allerdings im Widerspruch zum derzeitigen Dogma, wonach dieser Prozeß wesentlich durch die Zusammenlagerung zytosolischer Hüllproteine geprägt ist. Flippasen bewirken eine Umverteilung der Lipide quer über die Membrandoppelschicht und wir vermuten, dass sie damit die Membran-Vesikulierung antreiben. Wir prüfen diese Annahme durch die Rekonstitution von Flippasen in unilamellare Riesenvesikel.

Besonders spannend ist derzeit unsere Entdeckung eines möglichen Ceramid-Sensors, der die mitochondriale Apoptose unterdrückt. Ceramid ist der Vorläufer aller Sphingolipide, aber ebenso ein starker Vermittler des programmierten Zelltodes (Apoptose). Indem der Sensor den Ceramidgehalt im endoplasmatischen Retikulum (ER) überwacht, verhindert er den Übertritt von Ceramid in die Mitochondrien, was den Zelltod auslösen würde (Abbildung 2). Unsere aktuelle Forschung hat zum Ziel, die genaue Funktionsweise des Sensors aufzuklären und gleichzeitig die Proteine zu identifizieren, die den Ceramid-Transfer an den Kontaktstellen zwischen ER und Mitochondrien vermitteln (Abbildung 3).Desweiteren wird untersucht, ob sich der Ceramid-Sensor als Zielprotein eignet, um die Medikamenten-induzierte Apoptose in Tumorzellen zu modulieren.

Abbildung 2 Die Störung des Ceramidsensors SMSr bewirkt eine mitochondrial-initiierte Apoptose. Normalerweise erreichen nur geringe Mengen von neu synthetisiertem Ceramid die reaktiven Stellen von SMSr im Lumen des ER, da sie sehr effektiv vom Ceramid-Transfer-Protein von der zytosolischen Oberfläche entfernt werden (hier nicht gezeigt). SMSr wandelt Ceramid in Ceramid-Phosphatidylethanolamin um. Dieses verriegelt das Enzym in einer Konformation, die signalisiert, daß die Neusynthese von Ceramid blockiert werden soll. Somit bleiben die Ceramid-Konzentrationen im ER niedrig. Die Störung des SMSr hebt diese negative Rückkopplung auf, bewirkt einen Anstieg der Ceramidmengen im ER und damit ihren Übertritt in die Mitochondrien. Das wiederum macht die äußere Mitochondrienmembran durchlässig für Cytochrom C. Das Auftreten von Cytochrom C im Zytosol aktiviert Caspasen, die dann den programmierten Zelltod einleiten. Man beachte, daß Zellen mit defekten Sensoren (unten) von normalen Zellen (oben) durch Immunfärbung gegen Cytochrom C unterscheidbar sind (Rotfärbung in den Mikrographien, Blaufärbung zeigt DNA im Zellkern an).

Wir haben kürzlich ein europäisches Netzwerk namens Sphingonet initiiert. Es wird vom Marie- Curie-Förderprogramm unterstützt und nutzt chemische und systembiologische Ansätze für drei Ziele: 1) die Entwicklung synthetischer Sensoren zur Visualisierung von Ceramid und anderen Sphingolipid-basierten Signalmolekülen in lebenden Zellen, 2) die Erforschung von Schlüsselmechanismen der Sphingolipid-Homöostase, 3) die Erforschung der Bedeutung dieser Mechanismen für die Entwicklung gesunder und kranker Zellen.

Abbildung 3 Bifunktionale Lipidderivate zum Nachweis der Ceramid-Transportmaschinerie. (a) Struktur des photoaktivierbaren, reaktiven Ceramidanalogs pacCer. Proteine, die mit pacCer in Kontakt stehen, werden zunächst photoaffinitätsmarkiert und danach durch eine schnelle Weiterreaktion mit einem Reportermolekül (einem Fluorophor oder Biotin) derivatisiert („Click-Chemie“). Dies erlaubt dann ihre Visualisierung und Reinigung. (b) Mitochondrienmembranen wurden mit pacCer unter UV-Belichtung affinitätsmarkiert und danach mit einem Fluorophor modifiziert. Die Proteinextrakte wurden elektrophoretisch in ihre Bestandteile getrennt und entweder auf Fluoreszenz vermessen (links) oder mit dem Farbstoff Coomassie Blau (Mitte) angefärbt. Mutmaßliche Ceramid-Bindeproteine sind mit einem Sternchen gekennzeichnet (rechts).

Literaturauswahl

  • Puts CF, Panatala R, Hennrich H, Tsareva A, Williamson P, Holthuis JC (2012). Mapping functional interactions in a heterdimeric phospholipid pump. J. Biol. Chem.  287: 30529-30540.
  • Puts CF, Lenoir G, Krijgsveld J, Williamson P, Holthuis JC (2010). A P4-ATPase protein interaction network reveals a link between aminophospholipid transport and phospholipid metabolism. J. Proteome Res. 9: 833-842
  • Verhulst PM, van der Velden LM, Oorschot V, van Faassen EE, Klumperman J, Houwen RH, Pomorski TG, Holthuis JC, Klomp LW (2010). A flippase-independent function of ATP8B1, the protein affected in familial intrahepatic cholestasis type 1, is required for apical protein expression and microvillus formation in polarized epithelial cells. Hepatology 51: 2049-2060
  • Tafesse FG, Holthuis JC (2010) Cell biology: A brake on lipid synthesis. Nature 463: 1028-1029 
  • Vacaru AM, Tafesse FG, Ternes P, Kondylis V, Hermansson M, Brouwers JF, Somerharju P, Rabouille C, Holthuis JC (2009). Sphingomyelin synthase-related protein SMSr controls ceeramide homeostasis in the ER. J. Cell Biol. 185: 1013-1027
  • Holthuis JC, Levine TP (2005). Lipid traffic: floppy drives and a superhighway. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 209-220