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Biologie


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Juniorprof. Dr. Katia Cosentino

Juniorprof. Dr. Katia Cosentino

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Molekulare Zellbiophysik

Unsere Forschungsthemen kurz gefaßt:

•    Molekulare Mechanismen Poren-bildender Proteine beim regulierten Zelltod
•    Modernste biophysikalische Methoden wie Einzelmolekül-Bildgebung und
      Raster- (scanning) Mikroskopie
•    Mögliche Anwendungen bei Krebs und Entzündungserkrankungen

Molekulare Mechanismen der Membranporenbildung beim regulierten Zelltod

Die große Gruppe porenbildender Proteine spielt bei vielen biologischen Prozessen (Infektionen, Immunität, Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) eine wichtige Rolle. Die Porenbildner sind insofern auch von erheblicher klinischer Relevanz. Sie können beispielsweise als Angriffspunkte neuer antibakterieller Wirkstoffe oder zur Verbesserung von Krebstherapien dienen. Porenbildende Proteine zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, die äußere Zellmembran ebenso wie intrazelluläre Membranen durchlässig zu machen.  Dies erfordert unter anderem die raum/zeitliche Organisation der an der Porenbildung beteiligten Proteine.
Das Einbringen einer offenen Pore in eine Membran ist für die betroffene Zelle in der Regel tödlich, da die kontrollierte Durchlässigkeit der Zellmembran verloren geht und in Folge davon auch die Balance vieler zellulärer Prozesse. Andererseits ist dieser Ablauf aber auch Bestandteil von Angriff- und Verteidigungsstrategien und bei der Steuerung signalgebender Prozesse.
In meiner Arbeitsgruppe werden die molekularen Mechanismen untersucht, die die Membranporenbildung auslösen. Wir untersuchen sowohl Modellmembranen als auch lebende Zellen mit modernster  hochauflösender Mikroskopie. Der Fokus liegt auf porenbildenden Proteinen die am regulierten Zelltod (Stichworte Apoptose und Pyroptose) beteiligt sind.

Einzelmolekül- und Rastermikroskopie zur Visualisierung der Porenbildung in Membranen

Um die grundlegenden Abläufe einer Porenbildung zu verstehen, kombinieren wir neueste Techniken wie die Bildgebung mittels fluoreszierender Einzelmoleküle (fluorescence single molecule imaging (SMI) microscopy) mit Kraftmikroskopie (atomic force (AF) microscopy) und Spektroskopie sowohl in rekonstituierten Membranen als auch lebenden Zellen. Die Einzelmolekülbildgebung erfolgt mittels interner  Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und Photonen-detektierender konfokaler Mikroskopie. Damit werden quantitative Informationen bezüglich der Zusammenlagerung von Proteinkomplexen in der Membran zugänglich. Diese Ansätze werden durch nanoskopische Kraftmikroskopie und Spektroskopie ergänzt, die Hinweise auf supramolekulare Proteinstrukturen und den Beitrag von Membranlipiden zur Proteinfunktion liefern (Abbildung 1). In Kombination ergibt dies so bislang nicht verfügbare quantitative Informationen über die molekularen Mechanismen der Proteinzusammenlagerung und -funktion in ihrer natürlichen Membranumgebung.

Abbildung 1. Links: Ausbleichen markierter Bax-Oligomere in der TIRF-Mikroskopie (Maßstab 1 µm) und die Bildung von GFP-Bax-Oligomeren in apoptotischen Zellen (Maßstab 5 µm). Rechts: Nanoskopisches Bild einer Bax-Pore (Kraftmikroskopie) mitsamt ihrem Querschnitt.

Mit diesen experimentellen Ansätzen haben wir die Mechanismen der Zusammenlagerung und Porenbildung eines zentralen Bestandteils der mitochondriellen Apoptose ("progammierter Zelltod") charakterisiert (Bcl-2/Bax, Abbildung 2). Bax ist ein zentrales Stellglied der Porenbildung in der äußeren Mitochondrienmembran (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP). Die durch Bax gebildeten Poren erlauben die Freisetzung apoptotischer Faktoren wie Cytochrom C und SMAC ins Cytosol und initiieren so den programmierten Zelltod. Unsere Untersuchungen lieferten Schlüsselinformationen über die der Bax-Porenbildung zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen bei der Apoptose, dies ohne und gemeinsam mit anderen Proteinen der Bcl-2-Familie. Ihre spezifische Rolle im MOMP wurde somit herausgearbeitet.

Abbildung 2. A) Schematische Bax-Oligomerausbildung in Modellmembranen. B) Die Einzelmolekülanalyse zeigt, daß sich Bax in Membranen aus einem Gemisch von Dimeren zusammenlagert. C) Kraftmikroskopisches Bild eines bogenförmigen Bax-Oligomers (oben) und der zugehörige Poren-Querschnitt (unten).

Zusammenlagerung und Dynamik von GSDM-Proteinen bei der Pyroptose

Derzeit dehnen wir unsere Forschungsansätze auf andere Formen des regulierten Zelltods aus. In diesem Zusammenhang ist die Pyroptose zu sehen, ein hochentzündlicher, Zell-auflösender Prozeß, der durch Entzündungs-auslösende Caspasen als Reaktion auf Pathogene oder andere Gefahrensignale ausgelöst wird. Kürzlich wurde das Plasmamembran-permeabilisierende Protein Gasdermin D (GSDMD) als der finale Auslöser der Pyroptose identifiziert. Caspase spaltet die aktive N-terminale Domäne des GSDMD ab, die sich dann in der Plasmamembran zu großen porenbildenden Oligomeren zusammenlagert (Abbildung 3). Dies erlaubt die Sezernierung entzündungsfördernder Cytokine in den extrazellulären Raum. Letztlich resultiert eine Zellauflösung, die in die Zelle eingewanderte Pathogene körpereigenen Abwehrmechanismen zugänglich macht. Die porenbildende Funktionalität von GSDMD ist in der Gasdermin-Proteinfamilie konserviert, über die Mechanismen dieser den Zelltod bewirkenden Moleküle ist jedoch wenig bekannt. Hier setzt unsere Forschung an. Wir versuchen, die genaue Rolle unterschiedlicher Gasdermine beim regulierten Zelltod zu präzisieren.

Abbildung 3. Klassische und nicht-klassische entzündungsfördernde Pfade, die zur GSDMD-vermittelten Pyroptose mittels Plasmamembran-Permeabilisierung führen.

Literaturauswahl

  • Cosentino, K., and García‐Sáez, A.J. (2018). MIM through MOM: the awakening of Bax and Bak pores. The EMBO Journal 37, e100340.
  • Flores-Romero, H., Landeta, O., Ugarte-Uribe, B., Cosentino, K., García-Porras, M., García-Sáez, A.J., and Basañez, G. (2018). BFL1 modulates apoptosis at the membrane level through a bifunctional and multimodal mechanism showing key differences with BCLXL. Cell Death & Differentiation.
  • Cosentino, K., and García-Sáez, A.J. (2017). Bax and Bak Pores: Are We Closing the Circle? Trends in Cell Biology 27, 266-275.
  • Unsay, J.D.*, Cosentino, K.*, Sporbeck, K., and García-Sáez, A.J. (2017). Pro-apoptotic cBid and Bax exhibit distinct membrane remodeling activities: An AFM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1859, 17-27.
  • Salvador‐Gallego, R., Mund, M., Cosentino, K., Schneider, J., Unsay, J., Schraermeyer, U., Engelhardt, J., Ries, J., and García‐Sáez, A.J. (2016). Bax assembly into rings and arcs in apoptotic mitochondria is linked to membrane pores. The EMBO Journal 35, 389-401.
  • Cosentino, K.*, Ros, U. * and García-Sáez, A.J. (2016) Assembling the puzzle: Oligomerization of α-pore forming proteins in membranes. BBA Biomembranes 1858, 457-466.
  • Subburaj, Y.*, Cosentino, K.*, Axmann, M., Pedrueza-Villalmanzo, E., Hermann, E., Bleicken, S., Spatz, J., and García-Sáez, A.J. (2015). Bax monomers form dimer units in the membrane that further self-assemble into multiple oligomeric species. Nat Commun 6, 8042.
  • Cosentino, K., Bleicken, S., and García‐Sáez, A.J. (2015). Analysis of Membrane‐Protein Complexes by Single‐Molecule Methods. Pumps, Channels, and Transporters.
  • Cosentino K. and García-Sáez A. J. (2014) Mitochondria alterations in apoptosis. Chemistry and Physics of Lipids, 181, pp. 62-75.
    (* equal contribution)